WB ANALYSIS · BASIC GUIDE
WB 灰度分析基础操作说明书
适用于 WB 灰度分析3.1.0。用于从原始条带图建立 ROI、完成目标蛋白/内参归一化、整理生物学重复并导出 Prism 数据。
图片和实验数据只在本机处理。建议始终保留原始 TIFF 文件，并将项目文件与原图一起归档。
1. 开始前准备
- 安装或解压 Fiji / ImageJ，并确认可正常启动。
- 准备目标蛋白和内参原始图，优先使用未压缩的
.tif或.tiff。 - 同一次比较中的图片应尽量保持相同曝光策略，避免饱和条带。
- 先确认实际 lane 数和生物学重复数，再进入项目。
2. 新建和打开项目
- 在 WB 项目首页输入项目名，先设置 lane 数，再新建灰度分析项目。
- 选择“常规重复分析”或“多蛋白共享内参”。常规模式适合一个目标蛋白配一个内参；多蛋白模式适合多个目标蛋白共用同一张内参。
- 从文件夹中选择原图。拖入文件也可以，但项目归档时仍建议保存稳定的原始路径。
- 确认右上方分析名称，后续导出文件会使用该名称。
3. 常规重复分析
- 在上传前填写 lane 数；需要多个生物学重复时设置重复数量。
- 分别上传目标蛋白和 actin/GAPDH 等内参图。第二、第三重复会显示独立上传位。
- 如条带倾斜，先使用旋转角度或对齐线完成拉直，再执行“自动处理并识别 ROI”。
- 在组别输入框中核对默认的 1、2、3……，第一组默认为对照组；按实验设计修改组名。
- 点击“应用分组”，确认每个 lane 所属组别，再点击“测量统计”。
4. 多蛋白共享内参
- 上传一张共享内参图，并逐个增加目标蛋白。
- 每个目标蛋白必须与共享内参具有一致 lane 顺序。
- 可复制一组 ROI 到另一目标蛋白，再根据图像位置做小幅调整。
- 全部目标蛋白完成测量后，在图表方案中选择需要组合的蛋白和分组。
5. ROI 识别与精细调整
| 操作 | 用途 |
|---|---|
| 滚轮缩放 | 放大图像，便于检查条带边缘。 |
| 拖动 ROI | 移动当前选框；多选后可同步移动。 |
| 方向键 | 逐像素微调选框位置。 |
| 统一 ROI 大小 | 将当前宽度和高度应用到同一图的全部条带。 |
| 复制/粘贴 ROI | 在对应位置相近的目标蛋白与内参之间复用选框。 |
ROI 应完整覆盖条带，并尽量保持各 lane 框的尺寸一致。不要让框包含相邻条带或大面积异常背景。
6. 结果检查与 Prism 导出
- 先检查目标蛋白、内参的积分灰度和归一化结果是否存在异常值。
- “导出 Prism 分组表”用于保留原分组结构。
- 常规重复分析点击“导出 Prism Column 图表”时，软件会提示该文件按 Prism Column 数据表组织；确认后导出
.pzfx。 - 多蛋白模式可导出多个 Column 文件组成的 ZIP 图表包。
- CSV 明细适合复核每个 lane 的原始值；不要只保存最终柱状图。
7. 项目保存、自动保存和回收站
- 点击“保存项目”会写入项目库；按日期文件夹和自建文件夹均可检索。
- 返回项目首页或关闭软件时，可选择“保存”“不保存”或“取消”。
- 运行过程中会自动保存恢复信息，意外断电后可从项目首页继续。
- 删除项目会进入回收站，一个月内可以恢复。
8. 常见问题
提示找不到 Fiji / ImageJ
重新选择 Fiji 主程序路径，通常是 ImageJ-win64.exe 或 Fiji 安装目录中的启动程序。
ROI 自动识别不准确
先拉直图片、检查 lane 数，再适当调整 ROI 宽高和 rolling ball 参数；最后手动微调。
Prism 打开后图形不符合预期
确认使用的是 Column 导出按钮。Prism 版本或本机模板可能影响图形外观，但数据表结构和重复值应保持不变。