ABSOLUTE qPCR · STANDARD CURVE
qPCR 绝对定量详细说明书
利用已知标准品建立 Ct 与 log10(数量/浓度) 的线性回归，再反算未知样本，并保留每孔、技术重复和生物学样本三个层级。
1. 整体计算流程
- 输入多个浓度梯度的标准品和对应 Ct。
- 输入未知样本 Ct、稀释倍数、组别和重复信息。
- 设置标准品单位及样本换算关系。
- 计算标准曲线，检查斜率、R²、扩增效率和残差。
- 反算未知样本并导出每孔数据、生物样本汇总和 Prism 文件。
2. 标准品数据
- 标准品至少应覆盖实验预期范围，并包含多个数量级。
- 同一浓度的技术重复可填写多行；软件先求该浓度平均 Ct，再让各浓度梯度等权进入线性回归。
- 标准品数量必须为正数，Ct 必须为数字。
- 不要把浓度本身先手动取 log10 后再输入，软件会自动转换。
3. 未知样本数据
简洁输入格式为“样本名、Ct、稀释倍数”；高级表格可额外填写组别、生物样本 ID、技术重复 ID 和配对 ID。
| 字段 | 含义 |
|---|---|
| 组别 | 用于图表和组间整理。 |
| 生物样本 ID | 标识独立动物、培养孔或独立实验样本。 |
| 技术重复 ID | 同一生物样本的重复 qPCR 孔。 |
| 稀释倍数 | 模板在上机前的稀释倍数；未稀释填 1。 |
| 配对 ID | 需要配对比较时用于对应样本。 |
4. 单位和换算
- 标准品单位必须与实际配制一致，例如 copies/μL、copies/反应或质量浓度。
- 样本输出单位取决于标准品单位、上样体积、洗脱体积和稀释倍数。
- 软件中的稀释倍数会乘回原样浓度；不要在输入数据和设置中重复补偿同一次稀释。
- 报告中会记录换算说明，导出前应逐项核对。
5. 标准曲线质量检查
| 指标 | 核对重点 |
|---|---|
| R² | 反映线性拟合程度，阈值应按实验室方法学标准设置。 |
| 斜率 | 决定扩增效率；明显偏离预期时检查梯度配制、移液和阈值设置。 |
| 扩增效率 | 由斜率计算，不应脱离实验体系单独解释。 |
| 残差 | 用于发现某个标准浓度明显偏离拟合线。 |
| 未知样本范围 | 超出标准曲线范围的反算值应标记并谨慎解释。 |
6. 结果层级和核对
- 原始每孔结果用于追溯 Ct 和每个孔的反算值。
- 技术重复先在同一生物样本内汇总；组间统计使用生物样本层。
- 可同时查看原始数量和 log10 转换结果。
- 异常技术孔应按预先定义的 QC 规则处理，并保留处理记录。
7. Prism 和其他导出
- “生物样本汇总 Prism”将每个样本的汇总值写入 Column 表。
- “原始每孔 Prism”保留每个 Ct 孔，适合排查技术重复，不应直接冒充生物学重复做统计。
- log10 Prism 仅导出正值；零或无效值无法取对数。
- CSV 用于复核，SVG 用于继续排图，HTML 报告保存设置、曲线和关键 QC。
8. 常见问题
标准曲线无法计算
确认至少有足够的不同正浓度，且每个浓度有有效 Ct。检查是否把 log10 后的数值误当原始浓度输入。
结果相差一个稀释倍数
核对稀释倍数是否在输入和设置中被重复计算，以及标准品单位与最终单位是否一致。
点击 Prism 导出无反应
先完成计算并确认结果存在；从正式工作台进入模块，选择保存路径。如仍失败，先导出 CSV 核对数据并联系支持。